1背景介紹
支氣管哮喘是由多種細胞（如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T 淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等）和細胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾病，同時與氣道上皮損傷和脫落，氣道壁增厚及黏膜水腫引起氣道高反應(yīng)性（Airway hyperresponsiveness，AHR）有關(guān)。接觸刺激因素可導(dǎo)致氣道發(fā)生阻塞和氣流受限，出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶、咳嗽等癥狀。目前，治療哮喘的主要藥物有糖皮質(zhì)激素、抗生素、支氣管擴張劑等，用于控制哮喘癥狀，但仍有部分患者控制效果不佳，且長期服用激素類藥物對兒童身體產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)。因此，建立一個能夠模擬兒童哮喘的動物模型對于深入理解這種疾病的病理機制以及開發(fā)新的治療策略具有重要意義。豚鼠作為常用的實驗動物，因其遺傳背景清晰、氣道對過敏原的反應(yīng)與人類相似，常被用于哮喘的研究，而幼齡豚鼠器官和系統(tǒng)的發(fā)育尚未成熟，可以很好的模擬兒童哮喘的發(fā)作。OVA作為一種常見的過敏原，已被廣泛用于誘導(dǎo)各類動物模型產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和氣道重塑等哮喘癥狀。本研究旨在通過腹腔注射OVA后霧化吸入OVA誘導(dǎo)哮喘的方法，在幼齡豚鼠中建立肥胖哮喘模型。在模型建立后，對模型的肺功能和病理改變等主要指標(biāo)進行檢測，并采用陽性藥硫酸特布他林片考察模型的適用性，為兒童哮喘治療藥物開發(fā)提供合適的模型工具。
2 材料和方法
2.1試驗動物
健康Hartley豚鼠36只，SPF級，1~2周齡，體質(zhì)量105~172g。購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。
2.2主要試劑和儀器
（1）主要試劑：OVA；硫酸特布他林片；IgE ELISA試劑盒；戊巴比妥鈉
（2）主要儀器：超聲霧化器；低速冷凍離心機；酶標(biāo)分析儀；肺功能檢測系統(tǒng)；全自動血液體液分析儀
2.3試驗方法
（1）分組：在動物適應(yīng)性觀察結(jié)束之后，36只Hartley豚鼠適應(yīng)性觀察1周后，隨機分為3組，分別為對照組、模型組、特布他林組。
（2）造模：除對照組外，其他組動物均于第1、3、5天分別腹腔注射OVA溶液（10mg·mL
-1，每只0.5mL）致敏，從第20天起進行OVA霧化激發(fā)，采用不同濃度OVA溶液（0、0.165、0.3125、0.625mg·mL
-1）由低到高進行激發(fā)，每次激發(fā)2min，連續(xù)6d。
（3）給藥：特布他林組從激發(fā)前10 d開始灌胃給藥，連續(xù)16 d，每天1次，給藥體積10mL·kg
-1 ，直至激發(fā)結(jié)束。對照組及模型組用 0.9%氯化鈉溶液代替。
（4）檢測指標(biāo)：①先用2%戊巴比妥鈉溶液（2.0 ~ 2.5 mL·kg
-1 ）足趾靜脈注射麻醉，采用振蕩式肺功能檢測系統(tǒng)進行末次激發(fā)，測定肺功能指標(biāo)，包括呼吸系統(tǒng)阻力（Rrs）、呼吸系統(tǒng)彈性（Ers）和組織彈性。②動物腹主動脈采血并處死，開胸前先結(jié)扎氣管，然后將全肺取出，結(jié)扎左側(cè)肺部，用 10%福爾馬林溶液固定，用于組織病理學(xué)檢查。③右側(cè)肺收集肺泡灌洗液（BALF）用于白細胞數(shù)（WBC）和嗜酸性粒細胞數(shù) (EO) 測定，并計算嗜酸性粒細胞比率 （EO%）。④采集血漿用于檢測IgE含量。⑤取豚鼠完整肺組織，固定，包埋，切片，行HE 染色，顯微鏡下觀察。
3試驗結(jié)果
3.1 呼吸功能指標(biāo)的變化
在 0.165 mg·mL
-1 OVA 激發(fā)時，與對照組比較，模型組豚鼠 Rrs、Ers 和組織彈性顯著升高；在 0.313 mg·mL
-1 OVA 激發(fā)時，與對照組比較，模型組豚鼠 Rrs、Ers 和組織彈性水平顯著升高；與模型組比較，特布他林組豚鼠Rrs、Ers水平顯著降低。在0.625 mg·mL
-1 OVA 激發(fā)時，與對照組比較，模型組豚鼠Rrs、Ers和組織彈性水平顯著升高；與模型組比較，特布他林組Rrs水平明顯降低。詳細結(jié)果見表1~表3。
表1不同濃度 OVA 激發(fā)后對豚鼠Rrs的影響（n=6）
|
組別 |
OVA/(mg·mL-1) |
|
0 |
0.165 |
0.313 |
0.625 |
|
對照組 |
0.2261 ± 0.108 4 |
- |
- |
- |
|
模型組 |
0.1988 ± 0.0466 |
0.3890 ± 0.4072# |
0.4793 ± 0.3103## |
0.7866 ± 0.3429# |
|
特布他林組 |
0.1708 ± 0.0344 |
0.1949 ± 0.0355* |
0.2800 ± 0.1203* |
0.4140 ± 0.1974* |
注：與對照組比較，
#P＜0.05，
##P＜0.01，與模型組比較，
*P＜0.05，
**P＜0.01。
表2不同濃度 OVA 激發(fā)后對豚鼠 Ers 的影響（n=6）
|
組別 |
OVA/(mg·mL-1) |
|
0 |
0.165 |
0.313 |
0.625 |
|
對照組 |
2.6640 ± 0.7756 |
- |
- |
- |
|
模型組 |
2.7057 ± 0.5215 |
5.2575 ± 4.5844# |
6.5255 ± 3.0891# |
12.4505 ± 2.5977## |
|
特布他林組 |
2.7227 ± 0.5952 |
2.9590 ± 0.7840* |
4.9183 ± 2.8387 |
8.2830 ± 5.1144 |
注：與對照組比較，
#P＜0.05，
##P＜0.01，與模型組比較，
*P＜0.05，
**P＜0.01。
表3不同濃度 OVA 激發(fā)后對豚鼠組織彈性的影響（n=6）
|
組別 |
OVA/(mg·mL-1) |
|
0 |
0.165 |
0.313 |
0.625 |
|
對照組 |
1.909 3 ± 0.400 2 |
- |
- |
- |
|
模型組 |
1.947 3 ± 0.475 9 |
2.380 7 ± 0.858 5## |
2.413 5 ± 0.784 7## |
3.952 6 ± 0.879 3 # |
|
特布他林組 |
1.972 3 ± 0.464 6 |
2.034 4 ± 0.620 6** |
2.504 6 ± 0.820 8 |
4.690 6 ± 2.898 4 |
注：與對照組比較，
#P＜0.05，
##P＜0.01，與模型組比較，
*P＜0.05，
**P＜0.01。
3.2 對BALF中白細胞數(shù)和嗜酸性細胞數(shù)的影響
結(jié)果見表4。與對照組相比，模型組豚鼠BALF中嗜酸性粒細胞數(shù)及其比率顯著升高。與模型組相比，特布他林組嗜酸性粒細胞數(shù)稍有降低，但無顯著性差異。
表4 過敏性哮喘豚鼠血液中白細胞數(shù)和嗜酸性細胞數(shù)的水平（n=6）
|
組別 |
WBC/[(×109)·L-1] |
EO/[(×109)·L-1] |
EO比率/% |
|
對照組 |
0.77 ± 0.27 |
0.12 ± 0.05 |
15.71 ± 5.86 |
|
模型組 |
0.72 ± 0.17 |
0.26 ± 0.11# |
35.20 ± 8.40## |
|
特布他林組 |
0.84 ± 0.41 |
0.29 ± 0.15 |
34.76 ± 4.39 |
注：與對照組比較，
#P＜0.05，
##P＜0.01，與模型組比較，
*P＜0.05，
**P＜0.01。
3.3對血清中IgE影響
結(jié)果見圖1。與對照組比較，模型組豚鼠血清中IgE濃度顯著升高。與模型組相比，定喘組低劑量組豚鼠血清中IgE水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
圖1過敏性哮喘豚鼠血清中 IgE 的水平 （n=6）
注：1. 對照組；2. 模型組；3. 特布他林組。與對照組比較，
# P＜0.05。
3.4組織病理學(xué)檢查結(jié)果
結(jié)果見圖2。HE 染色結(jié)果顯示，對照組動物肺內(nèi)各級支氣管結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔無擴張或縮小，腔內(nèi)及周圍未見炎細胞浸潤。模型組多個支氣管周圍可見輕度嗜酸性粒細胞浸潤，支氣管黏膜壁增高，杯狀細胞增生，個別支氣管上皮脫落。硫酸特布他林組細支氣管周圍可見極輕度炎性細胞浸潤。
圖 2過敏性哮喘豚鼠肺組織的病理變化（HE 染色，×200）
4試驗結(jié)論與討論
肺功能檢查是評價氣流受限及其可逆性和變異性的重要方法。近年來，應(yīng)用脈沖震蕩方法測定氣道阻力在哮喘診斷中應(yīng)用較多，發(fā)作時可出現(xiàn)各類型氣道阻力增高。在本研究中采用強制振蕩評估豚鼠的氣道生理變化，隨著OVA濃度升高，豚鼠呼吸系統(tǒng)阻力、呼吸系統(tǒng)彈性和組織彈性增高，表明模型動物具有明顯的呼吸功能障礙。哮喘的病理基礎(chǔ)是慢性氣道炎癥，暴露過敏原導(dǎo)致豚鼠呼吸道中的細胞，特別是上皮細胞和炎癥細胞募集損傷氣道組織。在反復(fù)損傷和修復(fù)過程中，氣道平滑肌、上皮、血管和細胞外基質(zhì)可發(fā)生不可逆的改變，從而導(dǎo)致肺功能降低。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，模型動物肺部組織出現(xiàn)嗜酸性粒細胞浸潤，杯狀細胞增生及支氣管黏膜壁增高。IgE 濃度升高和嗜酸性粒細胞增多在過敏性哮喘病理學(xué)中起重要作用。當(dāng)接觸變應(yīng)原時IgE交聯(lián)使嗜酸性粒細胞和肥大細胞脫顆粒，釋放多種炎癥介質(zhì)加重哮喘反應(yīng)。綜上所述，本研究成功構(gòu)建了一種能夠模擬幼兒過敏性哮喘的動物模型，其病理學(xué)和生理學(xué)特性均滿足小兒過敏性哮喘患者的臨床表現(xiàn)，針對該模型，陽性藥硫酸特布他林治療效果顯著，表明了該模型對藥物的反應(yīng)敏感性，可用于后續(xù)兒童過敏性哮喘藥物的開發(fā)和評估。
微信截圖_17333831729026.png)
微信截圖_17333831866219(1).png)
