吸入制劑是利用特殊裝置，將溶解或分散于適宜介質(zhì)中的原料藥物霧化后，通過(guò)使用者主動(dòng)或被動(dòng)吸入氣溶膠或蒸氣的形式的藥物至肺部，進(jìn)而發(fā)揮局部或者全身作用的固體或液體制劑。目前，臨床上的吸入制劑按給藥形態(tài)主要可分為干粉吸入劑、吸入粉霧劑、吸入噴霧劑和吸入液體制劑。吸入制劑可直接到達(dá)肺部病灶等目的暴露部位，吸收快起效快，避免口服給藥的首過(guò)效應(yīng)，且具有便攜性好和病人服藥的依從性好等特點(diǎn)。近年，隨著吸入制劑的快速發(fā)展，吸入治療被世界衛(wèi)生組織WHO和歐美推薦為哮喘、慢性阻塞性肺?。–OPD）等呼吸道疾病治療的首選給藥方式，并且針對(duì)吸入給藥制劑PK研究的評(píng)價(jià)方法和手段也有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。
圖1 臨床上常見(jiàn)的吸入制劑
1.吸入給藥PK特點(diǎn)
不同于常規(guī)給藥制劑（口服制劑、注射劑等），吸入制劑進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)主要有兩條途徑：第一條為部分藥物經(jīng)肺部吸入后，經(jīng)過(guò)黏液層、上皮細(xì)胞、基底膜、間質(zhì)組織吸收入血；第二條為其余部分藥物沉積于口腔，通過(guò)吞咽至胃腸道吸收入血。藥物在肺部吸收的方式包括被動(dòng)擴(kuò)散、主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)、淋巴細(xì)胞吞噬等，一般來(lái)說(shuō)，藥物霧化后的粒徑大小和理化性質(zhì)對(duì)吸收方式及吸收部位有較大影響，如脂溶性較大的藥物吸收方式主要為被動(dòng)擴(kuò)散。
圖2吸入給藥體內(nèi)處置過(guò)程
對(duì)于治療肺部疾病的肺吸入制劑，其有效性主要取決于沉積在肺部的藥物量，而其安全性需要考慮兩個(gè)方面，包括局部安全性和全身安全性。由于肺部藥物代謝與肝腸代謝存在較大差異，肺部酶活性普遍較低，且表達(dá)模式也不同，因此需要特別關(guān)注藥物在肺部代謝物的暴露量、藥物間的相互作用、以及藥物是否可被肺部代謝酶活化等，以更好地評(píng)估其治療效果或毒性反應(yīng)。
2. 吸入制劑非臨床PK研究的特殊關(guān)注點(diǎn)
2.1 指導(dǎo)原則
對(duì)于人用藥，目前沒(méi)有針對(duì)吸入給藥途徑的指導(dǎo)原則，對(duì)于化學(xué)品或農(nóng)藥，有少數(shù)指導(dǎo)原則或標(biāo)準(zhǔn)指南；經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）化學(xué)品關(guān)于吸入給藥的內(nèi)容是各國(guó)指導(dǎo)原則中技術(shù)要求最詳細(xì)，涵蓋范圍最廣，要求最高的指導(dǎo)原則，也是吸入制劑非臨床PK研究中必須關(guān)注的指導(dǎo)原則。
圖3 OECD化學(xué)品相關(guān)指導(dǎo)原則
2.2 動(dòng)物種屬的選擇
吸入制劑非臨床藥動(dòng)學(xué)研究的動(dòng)物種屬選擇的基本原則與其他制劑基本相同，一般采用健康、成年的動(dòng)物進(jìn)行。在考慮與人體PK性質(zhì)相關(guān)性的前提下，盡可能選擇與毒理學(xué)和藥效學(xué)研究相同的動(dòng)物。對(duì)于系統(tǒng)暴露量較高的吸入制劑，代謝產(chǎn)物譜可提供動(dòng)物種屬選擇的關(guān)鍵性依據(jù)；對(duì)于局部暴露為主的吸入制劑，需關(guān)注局部組織特征或細(xì)胞類(lèi)型與人體的相似度。此外，還需重點(diǎn)評(píng)估動(dòng)物呼吸道解剖結(jié)構(gòu)對(duì)預(yù)測(cè)人體結(jié)果的影響，以及給藥過(guò)程中動(dòng)物的依從性。動(dòng)物的呼吸道解剖結(jié)構(gòu)決定受試物的分布沉積特征和給藥難度在候選藥物篩選、劑量探索等早期研究。創(chuàng)新性藥物應(yīng)選用兩種或兩種以上的動(dòng)物，其中一種為嚙齒類(lèi)動(dòng)物，另一種為非嚙齒類(lèi)動(dòng)物。非創(chuàng)新性藥物，可選用一種動(dòng)物，建議首選非嚙齒類(lèi)動(dòng)物。在藥物開(kāi)發(fā)初期，大鼠是吸入制劑非臨床藥動(dòng)學(xué)研究中最常用的動(dòng)物，可用于候選藥物篩選、劑量設(shè)計(jì)等。在動(dòng)物數(shù)量確定方面，由于吸入制劑的實(shí)際給藥劑量受諸多因素影響，包括給藥裝置的因素和動(dòng)物自身呼吸狀態(tài)等因素，難以測(cè)量和消除動(dòng)物呼吸狀態(tài)個(gè)體差異帶來(lái)的誤差，因此，可較常規(guī)給藥途徑適當(dāng)增加動(dòng)物數(shù)量。
2.3 給藥方式的選擇
動(dòng)物吸入給藥方式包括口鼻吸入給藥、氣管給藥、壓縮霧化給藥，各有優(yōu)缺點(diǎn)。氣管給藥可以精確定量給藥，但需在麻醉狀態(tài)下給藥，常用來(lái)開(kāi)展探索性試驗(yàn)。口鼻吸入給藥與實(shí)際臨床給藥方式相近，可以評(píng)估藥物在上呼吸道的暴露情況，無(wú)需麻醉，且一次可進(jìn)行多只動(dòng)物給藥，是申報(bào)藥代研究常用的給藥方式。壓縮霧化給藥與臨床給藥方式最相近，但無(wú)法評(píng)估實(shí)際給藥劑量。
表1 動(dòng)物吸入給藥方式
|
給藥方式 |
動(dòng)物
類(lèi)型 |
動(dòng)物
麻醉 |
血液樣品采集 |
氣溶膠采集 |
粒徑監(jiān)測(cè) |
藥物量 |
給藥難度 |
動(dòng)物數(shù) |
|
氣管給藥 |
小動(dòng)物 |
需要 |
隨時(shí)采集 |
不可以 |
不可以 |
少 |
適中 |
一次1只 |
口鼻吸入
給藥 |
大、小動(dòng)物 |
不需要 |
隨時(shí)采集 |
可以 |
可以 |
多 |
較難 |
一次多只 |
壓縮霧化
吸入 |
小動(dòng)物 |
不需要 |
不可以隨時(shí)采集 |
不可以 |
不可以 |
少 |
簡(jiǎn)單 |
一次1只 |
圖4 動(dòng)物吸入給藥示意圖
2.4 受試物分析——給藥準(zhǔn)確性監(jiān)測(cè)
為了確保在吸入給藥時(shí)遞送藥物的準(zhǔn)確性，在給藥期間需對(duì)藥物遞送劑量、遞送均一性和穩(wěn)定性及空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在非臨床研究階段，通常在正式給藥前需對(duì)霧化生成方法及含量檢測(cè)方法進(jìn)行受試物分析考察和驗(yàn)證。受試物分析是吸入給藥制劑非臨床評(píng)價(jià)中的一個(gè)重點(diǎn)和難點(diǎn)。受試物分析除了常規(guī)給藥制劑評(píng)估的給藥制劑的濃度、均一性和穩(wěn)定性外，還需檢測(cè)和驗(yàn)證氣溶膠顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)粒徑、遞送劑量、沉積劑量、給藥過(guò)程中氣溶膠濃度的穩(wěn)定性、不同給藥批次間氣溶膠濃度的穩(wěn)定性和均一性等。吸入制劑的給藥劑量會(huì)隨動(dòng)物狀態(tài)、給藥裝置的穩(wěn)定性、環(huán)境參數(shù)等改變，因此通常根據(jù)藥動(dòng)學(xué)探索研究來(lái)設(shè)定劑量。
遞送劑量的監(jiān)測(cè)
吸入制劑的非臨床PK研究常通過(guò)采樣瓶或合適的濾膜采集一定時(shí)間內(nèi)任意霧化通道霧化后的氣溶膠顆粒（一般連續(xù)多次采集）并通過(guò)高效液相色譜儀等方法檢測(cè)采樣瓶或?yàn)V膜中的藥物濃度，換算成氣溶膠中的藥物濃度，即可獲得一定霧化時(shí)間內(nèi)的藥物劑量。對(duì)于液體制劑（氣霧劑和噴霧劑），通常采用高效液相色譜法、氣相色譜法等方法檢測(cè)有效成分的含量。對(duì)于無(wú)揮發(fā)性的單一化合物，可采用稱(chēng)重法進(jìn)行氣溶膠濃度的檢測(cè)。OECD對(duì)液體和固體型氣溶膠濃度的允許偏差為±20%。
遞送穩(wěn)定性和均一性的考察
吸入制劑在持續(xù)霧化一定時(shí)間后，通過(guò)間斷采樣和檢測(cè)，可考察持續(xù)霧化的穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)霧化通道進(jìn)行分通道采樣，采集多個(gè)通道的樣品進(jìn)行檢測(cè)，可考察各霧化通道間的均一性。對(duì)于多層的小動(dòng)物單濃度口鼻動(dòng)態(tài)暴露吸入系統(tǒng)，還需對(duì)各層霧化通道進(jìn)行分通道采樣和檢測(cè)，以考察各層霧化通道間的均一性。霧化后各時(shí)間點(diǎn)和各通道的藥物濃度均應(yīng)在目標(biāo)濃度的±20%范圍內(nèi)。
空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布的監(jiān)測(cè)
氣溶膠中藥物顆粒的粒徑分布是影響藥物在呼吸道和肺部沉積的關(guān)鍵參數(shù)，因此，空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布是給藥過(guò)程中質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一。粒徑分布可通過(guò)多種測(cè)試方法定期檢測(cè)，測(cè)試方法主要包括碰撞法、激光衍射法和飛行時(shí)間粒徑分析法，前兩種方法較為常用。臨床上，F(xiàn)DA建議采用至少兩種原理的檢測(cè)方法進(jìn)行空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布的研究，且其中一種必須采用多級(jí)碰撞法。碰撞法是目前吸入制劑體外粒度分析最經(jīng)典的方法，也是美國(guó)和歐洲藥典評(píng)價(jià)吸入制劑體外粒度分布推薦使用的方法。比如《中國(guó)藥典》收載的雙層液體碰撞器，美國(guó)、歐洲藥典收載的Andersen多級(jí)撞擊器、Marple miler 多級(jí)撞擊器等。近年來(lái)，新一代多級(jí)慣性碰撞器使用普遍，質(zhì)量中值空氣動(dòng)力學(xué)直徑（MMAD）和幾何標(biāo)準(zhǔn)差（GSD）等常用來(lái)作為評(píng)價(jià)參數(shù)。
圖5 給藥準(zhǔn)確性監(jiān)測(cè)常用儀器
2.5 樣品采集
樣品采集除了常規(guī)的血漿采集外，需要特別關(guān)注藥物的呼吸道藥物分布以及灌洗液中的藥物濃度。在血樣采集時(shí)，對(duì)于吸收迅速、半衰期短的藥物需考慮給藥中采血，且需注意防止交叉污染。在進(jìn)行組織分布研究時(shí)，除采集心、肝、脾、腎、腦等主要組織器官外，還需關(guān)注呼吸系統(tǒng)組織器官如鼻咽（含鼻甲）、喉部（含會(huì)厭）、主氣管、支氣管、肺臟及肺灌洗液中藥物的分布，且灌洗液采集體積和停留時(shí)間需保持一致性，小組織如鼻粘膜、咽、喉、氣管、支氣管的采集方法也要保持一致性。
2.6 生物樣品分析
生物樣品的分析方法包括色譜法、免疫學(xué)法、放射性同位素標(biāo)記法和微生物學(xué)方法等。其中色譜法包括高效液相色譜法、氣相色譜法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；免疫學(xué)法包括放射免疫分析法、熒光免疫分析法、酶免疫分析法等。由于生物樣本藥物濃度低、樣品量少、內(nèi)源性物質(zhì)干擾多且個(gè)體差異大，應(yīng)根據(jù)藥物的性質(zhì)、生物樣品中藥物的濃度選擇不同的檢測(cè)方法。對(duì)于
系統(tǒng)暴露量低的吸入給藥制劑需盡早開(kāi)發(fā)靈敏度足夠的方法
圖6 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀
3 案例分享
LW23122是口服改吸入的改良型干粉吸入制劑，以期達(dá)到起效快、作用時(shí)間可控、提高生物利用度等效果。在開(kāi)展的大鼠口鼻暴露吸入給藥血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)試驗(yàn)研究中，試驗(yàn)選用30只SD大鼠，設(shè)單次吸入低、中、高劑量組（A、B、C）、多次吸入組（D）、原研經(jīng)口組（E），受試物低、中、高劑量組及多次給藥組動(dòng)物均采用精準(zhǔn)氣溶膠吸入給藥系統(tǒng)給藥，給藥時(shí)將大鼠放進(jìn)固定器中進(jìn)行吸入給藥，使用UPLC定量檢測(cè)截留藥物量。受試物低、中、高劑量組單次吸入給藥時(shí)長(zhǎng)分別為5min、10min、20min，實(shí)際遞送劑量分別為0.06mg/kg、0.14mg/kg、0.28mg/kg。多次給藥組吸入給藥時(shí)長(zhǎng)為10min，實(shí)際遞送劑量為0.15mg/kg，連續(xù)給藥7天；原研經(jīng)口組單次灌胃給予1.8mg/kg的原研片劑。受試物中、高劑量組動(dòng)物于給藥前、給藥中和給藥后采血；多次給藥組于第7天給藥前，給藥中和給藥后采血；受試物低劑量組、原研經(jīng)口組于給藥前和給藥后采血。各組動(dòng)物均于給藥前（0h）采集血樣；受試物中劑量組動(dòng)物于給藥中5min，受試物高劑量組動(dòng)物于給藥中10min，多次給藥組動(dòng)物于第7天給藥中5min采集血樣；受試物低、中、高劑量組均于單次給藥后0h、0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、24h采集血樣，多次給藥組于第7天給藥后0h、0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、24h采集血樣，市售對(duì)照品組動(dòng)物于單次給藥后0.083h、0.167h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h采集血樣。采用經(jīng)驗(yàn)證合格的LC-MS/MS方法檢測(cè)血漿中LW23122的濃度。使用Phoenix WinNonlin（V 8.1.0.3530）軟件對(duì)得到的藥物濃度進(jìn)行主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)T
max、C
max、t
1/2、AUC
(0-t)、MRT
(0-t) 統(tǒng)計(jì)分析。
吸入給藥后，實(shí)際遞送劑量比值與吸入給藥時(shí)長(zhǎng)比值（1:2:4）基本一致，說(shuō)明動(dòng)物吸入給藥系統(tǒng)穩(wěn)定。受試物低、中、高劑量組體內(nèi)藥物的暴露量AUC
(0-t)和達(dá)峰濃度C
max不同劑量組間的比值與實(shí)際遞送劑量比值基本一致，多次給藥后，未見(jiàn)蓄積。受試物中劑量組（0.14mg/mL）體內(nèi)藥物暴露量AUC
(0-t)與原研經(jīng)口組（1.8mg/kg）SD大鼠相當(dāng)，受試物中劑量組T
max明顯短于原研經(jīng)口組的T
max，提示相比于口服給藥，吸入給藥起效快，提高藥物的生物利用度。
圖7 LW23122吸入給藥血藥-濃度時(shí)間曲線(xiàn)圖
4 結(jié)語(yǔ)
非臨床PK研究在藥物研發(fā)早期的有效性和安全性評(píng)價(jià)中有著舉足輕重的作用，對(duì)于肺部吸入制劑這種特殊的給藥劑型，盡早開(kāi)展PK研究尤為重要。萊恩醫(yī)藥已成功建立大小動(dòng)物吸入制劑給藥平臺(tái)，擁有先進(jìn)的吸入給藥實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)以及經(jīng)驗(yàn)豐富的研究團(tuán)隊(duì)，已完成多個(gè)吸入制劑的藥效、藥代和毒理研究，順利完成IND申報(bào)。
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